Согласно определению английского физика Рэлея разрешение оптической системы естьминимальное расстояние между двумя точками формируемого ею изображения,пока они еще видны раздельно . Рэлей показал, что максимальное разрешение линзы (т.е. минимальное расстояние d между двумя соседними точками изображения) прямо пропорционально длине используемой световой волны l и обратно пропорционально показателю преломления среды n , а также углу раскрытия a :

Длина волны l равна произведению скорости света v на период колебаний T . Показатель преломления n определяется как отношение скорости света в вакууме (300000 км/сек) к скорости света v в данной среде. Для воздуха показатель преломления равен 1.0, для воды - 1.3, для кедрового масла - 1.5. Угол раскрытия a характеризует способность линзы собирать световые лучи. Он определяется как угол между двумя линиями, соединяющими край линзы с точкой ее переднего фокуса и, следовательно, зависит от диаметра линзы и ее кривизны (рис. 3). Максимальное значение a для современных объективов достигает 138 о.

Рис. 3. Угол раскрытия объектива a

Из формулы Рэлея также следует, что разрешение микроскопа можно повысить тремя способами:

1) уменьшением длины волны l (этот способ реализован в ультрафиолетовом и электронном микроскопах);

2) повышением показателя преломления среды n (иммерсионные объективы);

3) увеличением диаметра линз объектива (т.е увеличением угла a ).

Для того чтобы было удобно сравнивать разрешение различных объективов, Аббе выделил знаменатель формулы Рэлея в отдельный показатель - численную апертуру NA , после чего формула приняла следующий вид:

Численная апертура объектива NA = n * sin(a/2) характеризует его разрешающую способность вне зависимости от конструкции и применяемой длины волны. Введение усредняющего коэффициента 0.61 отражает тот факт, что максимальное разрешение обеспечивают только краевые лучи с максимальным углом a , тогда как близкие к центральному лучи дают разрешение в два раза ниже (рис 3). NA воздушных объективов всегда меньше 1
(n = 1, sin a < 1), но иммерсионные объективы могут иметь NA и больше 1. Величина численной апертуры объектива гравируется на его корпусе, что позволяет легко вычислить его номинальное разрешение, используя формулу Рэлея-Аббе. В этих расчетах обычно принимают, что средняя длина волны дневного света составляет 550 нм. Численная апертура современных иммерсионных объективов достигает значений 1.3 – 1.4. Рекорд в этой области принадлежит объективу фирмы Карл Цейсс с апертурой 1.45, который способен формировать изображения микроструктур размером 170 нм.

Кроме разрешения в плоскости препарата d (разрешения по полю), объектив микроскопа обладает также разрешением по глубине dz (Young, 1998).

Особую роль разрешение по глубине (глубина фокуса) играет в конфокальной микроскопии, где на основе оптических срезов создаются трехмерные реконструкции микроструктур и где толщина оптического среза сильно влияет на качество реконструкции. Поэтому в конфокальных микроскопах предусмотрены специальные аппаратные и программные средства, позволяющие уменьшать глубину фокуса. Как следует из формулы Янга для обычного микроскопа глубина фокуса dz почти не отличается от разрешения по полю d.

Вторым по значимости показателем объективов и окуляров является увеличение, которое также всегда указано на их оправе. Как правило, чем выше увеличение объектива, тем больше у него численная апертура (т.е. разрешение). Однако эта зависимость соблюдается не всегда - существуют объективы одного увеличения с разной и даже регулируемой апертурой, а объективы с высокой апертурой могут иметь пониженное увеличение. В связи с этим различают полезное и бесполезное увеличение , имея ввиду, что полезное увеличение связано с разрешением, а бесполезное - нет. По существу бесполезное увеличение представляет собой масштабирование изображения, при котором объем полученной информации остается прежним или даже снижается. Тем не менее, оно может понадобиться, например, при согласовании размеров поля зрения микроскопа и ПЗС-матрицы цифрового фотоаппарата.

Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и окуляра. В некоторых микроскопах следует учитывать также увеличение дополнительных линз, встроенных в бинокулярную насадку. В микроскопах, оборудованных телекамерами или цифровыми фотоаппаратами, к оптическому увеличению добавляется еще и электронное масштабирование. Поскольку общее увеличение микроскопа в этом случае будет зависеть от многих факторов, в научных публикациях вместо него принято указывать марку микроскопа, а также увеличение и апертуру используемого объектива (например, Zeiss Axiolab, x100/1.25).

Калибровка микроскопа . Если предполагается измерять размеры клеток и других микроструктур, микроскоп необходимо прокалибровать. Калибровка микроскопа производится с помощью специального препарата - объект-микрометра. Он представляет собой предметное стекло, в центре которого нанесена шкала с делениями ценой 10 мкм (рис. 4). Встречаются также объект-микрометры в виде металлической пластины с отверстием в центре, где укреплено стекло со светлой шкалой на темном фоне. Однако, они менее удобны из-за сложности фокусировки на шкалу, особенно при недостатке света на больших увеличениях.

Для определения размеров микрообъектов используется специальный измерительный окуляр (окуляр-микрометр), в котором также имеется шкала. Принцип калибровки заключается в определении цены деления шкалы окуляр-микрометра путем совмещения ее со шкалой
объект-микрометра. Зная цену деления объект-микрометра и число его делений, приходящихся на определенное число делений окуляр-микрометра, можно, разделив первое на второе, получить калибровочный фактор . Умножение калибровочного фактора на результаты измерений
окуляр-микрометром позволит приводить их к абсолютной величине, выраженной в микрометрах. Для повышения точности измерений применяются также усовершенствованные окуляр-микрометры, которые снабжены микрометрическим винтом, передвигающим указатель в поле зрения.

Если микроскоп имеет встроенную телекамеру или цифровой фотоаппарат, его калибровку проводят следующим образом:

1. Устанавливают объект-микрометр в микроскоп таким образом, чтобы его деления занимали строго вертикальное положение.

2. Фокусируют объектив на шкалу объект-микрометра и получают ее цифровой снимок (рис. 4).

3. С помощью программы обработки изображений Scion Image (или аналогичной) получают строго горизонтальный профиль яркости вдоль шкалы.

4. Измеряют число пикселов (элементов растра) в отрезке, соединяющем два достаточно далеко отстоящих друг от друга деления шкалы.

5. Вычисляют калибровочный фактор, разделив длину отрезка (мкм) на измеренное в нем число пикселов.

Рис. 4. Шкала объект-микрометра (слева) и ее профиль яркости (справа).

Объектив х10, цена деления 10 мкм. На шкале дополнительно показана линия профиля яркости. Расстояние между крайними делениями вдоль этой линии составляет 400 мкм или 265 пикселов. Калибровочный фактор равен 1.509 (400/265).

Этот способ калибровки микроскопа проводится быстро и обладает высокой точностью (ошибка менее 1%). Естественно, калибровка должна проводиться для каждого объектива отдельно, даже если они имеют одинаковое номинальное увеличение.

Измерение разрешающей способности микроскопа. Формула Рэлея-Аббе позволяет рассчитать только номинальное (т.е. теоретически ожидаемое) разрешение объектива. Действительное разрешение объектива (и микроскопа в целом) может значительно отличаться от номинального.

Если микроскоп оборудован телекамерой или цифровым фотоаппаратом, измерение его реальной разрешающей способности не представляет большой проблемы. Для этого, однако, необходимо более подробно рассмотреть принцип его работы.

Описанная выше диффракция Френеля в виде концентрических круглых колец (рис. 1) возникает только в том случае, если световая волна обладает полной когерентностью. Обладающая частичной когерентностью система освещения микроскопа будет формировать диффракционую картину без выраженных колец. Более того, из-за неидеальности оптики обратное преобразование Фурье также даст изображение, сглаженное по сравнению с исходным. Следовательно, микроскоп вносит погрешность в процесс формирования изображения, что приводит к снижению его разрешающей способности. Для оценки этой погрешности в микроскопии применяют функцию рассеяния точки (P oint S pread F unction, PSF ) и функцию оптической передачи (O ptical T ransfer F unction, OTF ).

Рис. 5. Функция рассеяния точки (PSF ) и функция оптической передачи (OTF ). OTF является Фурье-образом PSF.

По существу, PSF представляет собой наблюдаемое в микроскоп изображение круглого отверстия минимального диаметра, которое освещено некогерентным светом, а OTF является его Фурье-образом (рис. 5). Чем меньше PSF (и больше сопряженная с ним OTF), тем выше разрешение. Таким образом, задача измерения разрешающей способности микроскопа сводится к определению его PSF (или OTF).

Существует много различных способов прямой и косвенной оценки величины PSF. Например, ее можно вычислить, если исследовать форму перепадов яркости в окрестностях границ микрообъектов. На практике, однако, наиболее простым и точным способом оценки максимального разрешения микроскопа является анализ его OTF, а не PSF.

Для того чтобы измерить разрешающую способность микроскопа при данном увеличении по OTF, необходимо:

1. Получить цифровую фотографию цитологического препарата.

2. Чтобы была возможность применить быстрый алгоритм преобразования Фурье, вырезать из нее квадратный участок, сторона которого L (в пикселах) равна степени числа 2 (128,256,512 и т. д.).

3. Выполнить прямое преобразование Фурье этого участка с помощью программы Scion Image (или аналогичной) и получить OTF микроскопа.

4. Измерить диаметр OTF (D) в пикселах (рис. 5).

5. Используя полученные параметры L и D , а также размеры ячейки матрицы камеры C в мкм, увеличение адаптера камеры Ma иувеличение объектива Mo ,рассчитать максимальное разрешение микроскопа d в нм по формуле:

Рис. 6. Изображение анафазы митоза (256х256) и его Фурье-образ.

Цифровая фотография делящейся митозом клетки корешка лука (рис. 6, слева) снята при помощи микроскопа Zeiss Axiolab, объектив x100/1.25, камера Axiocam MR с адаптером x0.63, размер ячейки ПЗС-матрицы 6.7 мкм (указан в спецификации). Фурье-образ этого снимка (рис. 6, справа) получен в программе Scion Image после кадрирования рамкой 256х256. Измеренный с помощью программы Scion Image диаметр OTF составляет 129 пикселов, рассчитанное по приведенной формуле разрешение микроскопа - 211 нм.

Точность данного метода измерения разрешающей способности микроскопа зависит, главным образом, от корректности определения диаметра OTF. Однако, как видно из профиля яркости OTF (рис. 7), ее граница плавно снижается к уровню случайного шума, что затрудняет измерение D .

Один из способов повышения объективности определения диаметра OTF заключается в том, чтобы измерять его (или радиус OTF, который обозначается как HWHM ) на половине максимальной яркости сигнала. Оценка разрешения микроскопа при этом будет несколько ниже максимального значения.

Другой способ состоит в использовании специальных препаратов, приготовленных из диатомовых водорослей и содержащих мелкие регулярные структуры на пределе разрешения микроскопа. В этом случае в Фурье-образе появляются контрастные рефлексы, которые значительно облегчают точное измерение диаметра OTF.

Рис. 7. Профиль яркости OTF от центра к периферии. HWHM - радиус OTF на уровне половины ее максимума (H alf W idth on H alf M aximum).

PSF и OTF непосредственно связаны с формулой Рэлея-Аббе. В свободном от аберраций микроскопе PSF обладает круговой симметрией и определяется выражением

где h(r) – это PSF, J 1 - функция Бесселя первого рода, a = 2pNA/l.

Таким образом, по крайней мере, в идеальном случае форма PSF определяется только двумя параметрами - длиной волны l и численной апертурой объектива NA. Аналитическое описание PSF может использоваться для повышения разрешающей способности микроскопа путем дополнительной обработки изображений на компьютере.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Формула для увеличения микроскопа

Качество изображения определяется разрешающей способностью микроскопа , т.е. минимальным расстоянием, на котором оптика микроскопа может различить раздельно две близко расположенные точки. разрешающая способность зависит от числовой апертуры объектива, конденсора и длины волны света, которым освещается препарат. Числовая апертура (раскрытие) зависит от угловой апертуры и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и конденсора и препаратом.

Кроме разрешающей способности системы, числовая апертура характеризует светосилу объектива: интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA.

Предел разрешения – наименьшее расст. Между двумя близко расположенными точками предмета, разлизимыми в микроскоп(воспринимаемыми как две точки).

Апертура (лат. apertura - отверстие) в оптике - характеристика оптического прибора, описывающая его способность собирать свет и противостоять дифракционному размытию деталей изображения. В зависимости от типа оптической системы эта характеристика может быть линейным или угловым размером. Как правило, среди деталей оптического прибора специально выделяют, так называемую, апертурную диафрагму, которая сильнее всего ограничивает диаметры световых пучков, проходящих через оптический инструмент. Часто, роль такой апертурной диафрагмы выполняет оправа или, просто, края одного из оптических элементов (линзы, зеркала, призмы).

Угловая апертура - угол между крайними лучами конического светового пучка на входе (выходе из) оптической системы.

Числовая апертура - равна произведению показателя преломления среды между предметом и объективом на синус апертурного угла. Именно эта величина наиболее полно определяет одновременно светосилу, разрешающую способность объектива микроскопа. Для увеличения числовой апертуры объективов в микроскопии пространство между объективом и покровным стеклом заполняют иммерсионной жидкостью.

Угловая апертура объектива - это максимальный угол (AOB), под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через препарат. Числовая апертура объектива равна произведению синуса половины угловой апертуры на показатель преломления среды, находящейся между предметным стеклом и фронтальной линзой объектива. N.A. = n sinα где, N.A. - числовая апертура; n - показатель преломления среды между препаратом и объективом; sinα - синус угла α равного половине угла АОВ на схеме.

Таким образом, апертура сухих систем (между фронтальной линзой объектива и препаратом-воздух) не может быть более 1 (обычно не более 0,95). Среда, помещаемая между препаратом и объективом, называется иммерсионной жидкостью или иммерсией, а объектив, рассчитанный для работы с иммерсионной жидкостью, называют иммерсионным. Благодаря иммерсии с более высоким показателем преломления чем у воздуха, можно повысить числовую апертуру объектива и, следовательно, разрешающую способность.

Числовая апертура объективов всегда гравируется на их оправах.

Разрешающая способность микроскопа зависит также от апертуры конденсора. Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет вид R=λ/2NA, где R - предел разрешения; λ - длина волны; N.A - числовая апертура. Из этой формулы видно, что при наблюдении в видимом свете (зеленый участок спектра - λ=550нм), разрешающая способность (предел разрешения) микроскопа не может быть > 0,2мкм

Иммерсия (от лат. immersio - погружение) - жидкость, заполняющая пространство между объектом наблюдения и специальным иммерсионным объективом (конденсором и предметным стеклом). В основном применяются три типа иммерсионных жидкостей: масляная иммерсия (МИ/Oil), водная иммерсия (ВИ/W) и глицериновая иммерсия (ГИ/Glyc), причем последняя в основном применяется в ультрафиолетовой микроскопии.

Иммерсия применяется в тех случаях, когда требуется повысить разрешающую способность микроскопа или ее применения требует технологический процесс микроскопирования. При этом происходит:

1. повышение видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта;

2. увеличение глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды.

Кроме того, иммерсионная жидкость может уменьшать количество рассеянного света за счет исчезновения бликов от объекта. При этом устраняются неизбежные потери света при его попадании в объектив.

Рефракция света - изменение направления световых лучей в среде с изменяющимся в пространстве показателем преломления п. Обычно термином «Р. с.» пользуются при описании распространения оптич. излучения в неоднородных средах с плавно меняющимся п от точки к точке (траектории лучей света в таких средах - плавно искривляющиеся линии). Резкое изменение направления лучей на границе раздела двух однородных сред с разными п обычно наз. преломлением света. В атм. оптике, очковой оптике традиционно используют именно термин «рефракция». Т. к. атмосфера является неоднородной средой, то вследствие Р. с. происходит смещение видимого положения небесных светил относительно истинного, что необходимо учитывать в астрономии. Р. с. в атмосфере должна учитываться и при геодезич. измерениях. Р. с. является причиной миражей. Явление Р. с. позволяет визуализировать оптич. неоднородности в твёрдых, жидких и газовых средах.

Рефрактометр ия (от лат. refractus - преломленный и греч. metreo - измеряю) - это метод исследования веществ, основанный на определении показателя (коэффициента) преломления (рефракции) и некоторых его функций. Рефрактометрия (рефрактометрический метод) применяется для идентификации химических соединений, количественного и структурного анализа, определения физико-химических параметров веществ.

Показатель преломления n, представляет собой отношение скоростей света в граничащих средах. Для жидкостей и твердых тел n обычно определяют относительно воздуха, а для газов - относительно вакуума. Значения n зависят от длины волны l света и температуры, которые указывают соответственно в подстрочном и надстрочном индексах. Методы рефрактометрии делятся на две большие группы: объективные и субъективные. Несмотря на бесспорное преимущество объективных методов, каждое объективное исследование, как правило, завершается корректировкой субъективными методами.Объективные методы. Различают две подгруппы объективных методов рефрактометрии:

1. Объективные по отношению к пациенту и субъективные по отношению к врачу. Примером может служить скиаскопия, объективные данные которой могут быть получены через субъективную оценку врачом скиаскопического рефлекса исследуемого.2. Объективный по отношению и к исследуемому, и исследующему, реализуемый при помощи рефрактометрического автомата.

Поляризация света - физ. характеристика оптич. излучения, описывающая поперечную анизотропию световых волн, т. е. неэквивалентность разл. направлений в плоскости, перпендикулярной световому лучу. Существ. значение для понимания П. с. имело её проявление в эффектах интерференции света и, в частности, тот факт, что два световых луча с взаимно перпендикулярными плоскостями поляризации непосредственно не интерферируют. П. с. нашла естеств. объяснение в эл.-магн. теории света, разработанной в 1865-73 Дж. К. Максвеллом (J. С. Maxwell), позднее - в квантовой электродинамике.

Термин поляризация волн был введен Малюсом применительно к поперечным механическим волнам

Для получения поляризованного света и его обнаружения существуют специальные физические приборы, называемые в первом случае поляризаторами, а во втором анализаторами. Обычно они устроены одинаково.Существует.несколько способов получения и анализа поляризованного света.

1. Поляризация при помощи поляроидов. Поляроиды представляют собой целлулоидные пленки с нанесенным на них тончайшим слоем кристалликов сернокислого нодхинина. Применение полярой^ дов является в настоящее время наиболее распространенным способом поляризации света.

2. Поляризация посредством отражения. Если естественный луч света падает на черную полированную поверх ность, то отраженный луч оказывается частично поляризованным. В качестве поляризатора и анализатора может быть употреблено зеркальное или достаточно хорошо отполированное обычное оконное стекло, зачерненное с одной стороны асфальтовым лаком.Степень поляризации тем больше, чем правильнее выдержан угол падения. Для стекла угол падения равен 57°.

3. Поляризация посредством п р е л о м л е н и я. Световой луч поляризуется не только при отражении, но и при

преломлении. В этом случае в качестве поляризатора и анализатора используется стопка

сложенных вместе 10-15 тонких стеклянных пластинок, расположенных к падающим на них световым лучам под углом в 57°.

Призма Николя (сокр. николь ) - поляризационное устройство, в основе принципа действия которого лежат эффекты двойного лучепреломления и полного внутреннего отражения.Призма Николя представляет собой две одинаковые треугольные призмы из исландского шпата, склеенные тонким слоем канадского бальзама. Призмы вытачиваются так, чтобы торец был скошен под углом 68° относительно направления проходящего света, а склеиваемые стороны составляли прямой угол с торцами. При этом оптическая ось кристалла (AB ) находится под углом 64° с направлением света.

Апертура полной поляризации призмы составляет 29°. Особенностью призмы является изменение направления выходящего луча при вращении призмы, обусловленное преломлением скошенных торцов призмы. Призма не может применяться для поляризации ультрафиолета, так как канадский бальзам поглощает ультрафиолет.Свет с произвольной поляризацией, проходя через торец призмы испытывает двойное лучепреломление, расщепляясь на два луча - обыкновенный, имеющий горизонтальную плоскость поляризации (AO ) и необыкновенный, с вертикальной плоскостью поляризации (АE ). После чего обыкновенный луч испытывает полное внутреннее отражение о плоскость склеивания и выходит через боковую поверхность. Необыкновенный беспрепятственно выходит через противоположный торец призмы.

Закон Брюстера - закон оптики, выражающий связь показателя преломления с таким углом, при котором свет, отражённый от границы раздела, будет полностью поляризованным в плоскости, перпендикулярной плоскости падения, а преломлённый луч частично поляризуется в плоскости падения, причем поляризация преломленного луча достигает наибольшего значения. Легко установить, что в этом случае отраженный и преломленный лучи взаимно перпендикулярны. Соответствующий угол называется углом Брюстера .

Это явление оптики названо по имени шотландского физика Дэвида Брюстера, открывшего его в 1815 году.

Закон Брюстера : , где n 12 - показатель преломления второй среды относительно первой, θ Br - угол падения (угол Брюстера).

При отражении от одной пластинки под углом Брюстера интенсивность линейно поляризованного света очень мала (около 4% от интенсивности падающего луча). Поэтому для того, чтобы увеличить интенсивность отраженного света (или поляризовать свет, прошедший в стекло, в плоскости, параллельной плоскости падения) применяют несколько скрепленных пластинок, сложенных в стопу – стопу Столетова. Легко проследить по чертежу происходящее. Пусть на верхнюю часть стопы падает луч света. От первой пластины будет отражаться полностью поляризованный луч (около 4% первоначальной интенсивности), от второй пластины также отразится полностью поляризованный луч (около 3,75% первоначальной интенсивности) и так далее. При этом луч, выходящий из стопы снизу, будет все больше поляризоваться в плоскости, параллельной плоскости падения, по мере добавления пластин.Понятие полного преломления имеет важное значение для радиосвязи: большинство штыревых антенн излучает именно вертикально поляризованные волны. Таким образом, если волна падает на поверхность раздела (землю, воду или ионосферу) под углом Брюстера, отраженной волны не будет, соответсвенно канал будет отсутствовать.

Закон Малюса - зависимость интенсивности линейно-поляризованного света после его прохождения через поляризатор от угла между плоскостями поляризации падающего света и поляризатора, где I 0 - интенсивность падающего на поляризатор света, I - интенсивность света, выходящего из поляризатора.Свет с иной (не линейной) поляризацией может быть представлен в виде суммы двух линейно-поляризованных составляющих, к каждой из которых применим закон Малюса. По закону Малюса рассчитываются интенсивности проходящего света во всех поляризационных приборах, например в поляризационных фотометрах и спектрофотометрах. Потери на отражение, зависящие от и не учитываемые законом Малюса, определяются дополнительно.

Оптически активные вещества , среды, обладающие естественной оптической активностью . О.-а. в. подразделяются на 2 типа. Относящиеся к 1-му из них оптически активны в любом агрегатном состоянии (сахара, камфора, винная кислота), ко 2-му - активны только в кристаллической фазе (кварц, киноварь). У веществ 1-го типа оптическая активность обусловлена асимметричным строением их молекул, 2-го типа - специфической ориентацией молекул (ионов) в элементарных ячейках кристалла (асимметрией поля сил, связывающих частицы в кристаллической решётке). Кристаллы О.-а. в. всегда существуют в двух формах - правой и левой; при этом решётка правого кристалла зеркально-симметрична решётке левого и не может быть пространственно совмещена с нею (т. н. энантиоморфные формы, см. Энантиоморфизм ). Оптической активности правой и левой форм О.-а. в. 2-го типа имеют разные знаки (и равны по абсолютной величине при одинаковых внешних условиях), поэтому их называется оптическими антиподами (иногда так называют и кристаллы О.-а. в. 1-го типа).

Вращение плоскости поляризации света - объединённая общим феноменологич. проявлением группа эффектов, заключающихся в повороте плоскости поляризации поперечной волны в результате взаимодействия с анизотропной средой. Наиб. известностью пользуются эффекты, связанные с В.п.п. света, хотя аналогичные явления наблюдаются и в др. областях спектра эл.-магн. волн (в частности, в СВЧ-диапазоне), а также в акустике, физике элементарных частиц и т. д.В. п. п. обычно обусловлено различием коэф. преломления среды для двух циркулярно поляризованных (по правому и левому кругу) волн (т.н. циркулярной анизотропией) и описывается в общем случае аксиальным тензором второго ранга, связывающим аксиальный вектор угла поворота плоскости поляризации с полярным волновым вектором . В среде, обладающей только циркулярной анизотропией, линейно поляризованная волна может быть разложена на две нормальные циркулярно поляризованные волны равной амплитуды (см. Нормальные колебания ),разность фаз между к-рыми определяет азимут плоскости поляризации суммарной волны В однородных средах, обладающих циркулярной анизотропией, угол В. п. п. линейно зависит от длины пути в среде. Циркулярная анизотропия может быть как естественной (спонтанной, присущей среде в невозмущённом состоянии), так и искусственной, индуцированной внеш. воздействием. Во втором случае циркулярная асимметрия может быть обусловлена асимметрией возмущающего воздействия или совокупными симметрийными свойствами среды и возмущения

Угол поворота . Луч света может быть естественным и поляризованным. В естественном луче света колебания вектора происходит неупорядоченно.

Поляризованные лучи света в свою очередь подразделяются на линейно-поляризованные, когда колебания происходят по прямой, перпендикулярной к лучу; поляризованные по кругу, когда конец вектора описывает окружность в плоскости, перпендикулярной к направлению луча, и эллиптически-поляризованные, в которых колебания совершаются по эллипсу.

Плоскость, в которой происходят колебания в плоско-поляризованном луче, называется плоскостью колебания.

Плоскость, проходящая через направление поляризованного луча и перпендикулярная к плоскости колебания, называется плоскостью поляризации.

Световые волны с помощью приборов-поляризаторов (поляроид, пластинка турмалина, николь и др.) могут быть поляризованы.

Световая микроскопия

Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Основными характеристиками любого микроскопа являются разрешающая способность и контраст. Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.

Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов – 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива. Светосила объектива -интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.

Методы световой микроскопии

Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля и его разновидности

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля и его разновидности

Метод тёмного поля в проходящем свете (Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции - т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect) , известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Проведение темнопольного исследования

Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

Настройка темнопольного освещения в основном заключается в следующем:

Устанавливают свет по Келеру;

Заменяют светлопольный конденсор темнопольным;

На верхнюю линзу конденсора наносят иммерсионное масло или дистиллированную воду;

Поднимают конденсор до соприкосновения с нижней поверхностью предметного стекла;

Объектив малого увеличения фокусируют на препарат;

С помощью центрировочных винтов переводят в центр поля зрения светлое пятно (иногда имеющее затемненный центральный участок);

Поднимая и опуская конденсор, добиваются исчезновения затемненного центрального участка и получения равномерно освещенного светлого пятна.

Если этого сделать не удается, то надо проверить толщину предметного стекла (обычно такое явление наблюдается при использовании слишком толстых предметных стекол - конус света фокусируется в толще стекла).

После правильной настройки света устанавливают объектив нужного увеличения и исследуют препарат.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип – препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц с×частиц размером до 2×10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Метод фазового контраста

Метод фазового контрастаи его разновидность - т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:

Набора объективов со специальными фазовым пластинками;

Конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;

Вспомогательного телескопа для настройки фазового контраста.

Настройка фазового контраста заключается в следующем:

Заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквами Ph) ;

Устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой "0");

Настраивают свет по Келеру;

Выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат;

Поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму;

где l – расстояние между верхним фокусом объектива и нижним фокусом окуляра; L – расстояние наилучшего видения; равное 25 см; F 1 и F 2 – фокусные расстояния объектива и окуляра.

Зная фокусные расстояния F 1 , F 2 и расстояние между ними l можно найти увеличение микроскопа.

На практике не используются микроскопы с увеличением свыше 1500–2000, т.к. возможность различения мелких деталей объекта в микроскопе ограничена. Это ограничение обусловливается влиянием дифракции света, в проходящей структуре данного объекта. В связи с этим пользуются понятиями предела разрешения и разрешающей способности микроскопа.

Определение предела разрешения микроскопа

Пределом разрешения микроскопа называется то наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором они видимы в микроскопе раздельно. Это расстояние определяется по формуле:

,

где λ – длина волны света; n – показатель преломления среды между объективом и объектом; u – апертурный угол объектива, равный углу между крайними лучами конического светового пучка, входящего в объектив микроскопа.

Реально свет от предмета распространяется к объективу микроскопа в некотором конусе (рис. 2 а), который характеризуется угловой апертурой – углом u между крайними лучами конического светового пучка, входящего в оптическую систему. В предельном случае, согласно Аббе, крайними лучами конического светового пучка будут лучи, соответствующие центральному (нулевому) и 1-му главному максимумам (рис. 2 б).

Величина 2nsin U называется числовой апертурой микроскопа. Числовая апертура может быть увеличена с помощью специальной жидкой среды – иммерсии – в пространстве между объективом и покровным стеклом микроскопа.

В иммерсионных системах по сравнению с тождественными "сухими" системами получают больший апертурный угол (рис. 3).

Рис.3. Схема иммерсионной системы

В качестве иммерсии используют воду (n = 1,33), кедровое масло (n = 1,514) и др. Для каждой иммерсии специально рассчитывают объектив, и его можно применять только с данной иммерсией.

Из формулы видно, что предел разрешения микроскопа зависит от длины волны света и числовой апертуры микроскопа. Чем меньше длина волны света и чем больше величина апертуры, тем меньше Z, а, следовательно, больше предел разрешения микроскопа. Для белого (дневного) света можно принять среднее значение длины волны λ = 0,55мкм. Показатель преломления для воздуха равен n = 1.

Микроскоп мбс-1

МБС-1 – cтереоскопический микроскоп, дающий прямое объемное изображение рассматриваемого предмета как в проходящем, так и в отраженном свете.

Микроскоп состоит из 4 основных частей:

– cтолик;

– штатив;

– оптическая головка с механизмом грубой подачи;

– окулярная насадка.

Столик микроскопа состоит из круглого корпуса, внутри которого вмонтирован поворотный отражатель с зеркальной и матовой поверхностями. Для работы с дневным освещением в корпусе предусмотрен вырез, через который свободно проходит свет. С задней стороны корпуса столика имеется резьбовое отверстие для работы с электрическим осветителем. На штативе микроскопа крепится оптическая головка – основная часть прибора, в которую вмонтированы наиболее ответственные оптические узлы.

В корпусе оптической головки помещен барабан с с установленными в нем галилеевыми системами. Вращением оси барабана с помощью рукояток с нанесенными цифрами 0,6; 1; 2; 4; 7 добиваются различного увеличения объективов. Каждое положение барабана четко фиксируется специальным пружинным фиксатором. С помощью рукоятки на штативе микроскопа, перемещающей оптическую головку, добиваются наиболее резкого изображения рассматриваемого объекта.

Вся оптическая головка может перемещаться по стержню штатива и закрепляться в любом положении с помощью винта. Окулярная насадка состоит из направляющей, представляющей прямоугольную деталь с двумя отверстиями для оправ объективов.

Наблюдая в окуляры нужно разворотом окулярных трубок найти такое положение, при котором два изображения сводятся в одно. Далее произвести фокусировку микроскопа на исследуемый предмет, а вращением отражателя добиться равномерного освещения поля. При настройке освещенности патрон с лампой перемещается в сторону коллектора до получения наилучшей освещенности наблюдаемого объекта.

В основном МБС-1 предназначен для препарировальных работ, для наблюдения объектов, а также для проведения линейных измерений или измерений площадей участков препарата. Оптическая схема микроскопа представлена на рис. 4.

Оптическая схема микроскопа МБС-1 представлена на рис. 4.

При работе в проходящем свете источник света (1) с помощью отражателя (2) и коллектора (3) освещает прозрачный препарат, установленный на предметный столик (4).

В качестве объектива применена специальная система, состоящая из 4-х линз (5) с фокусным расстоянием = 80 мм и 2-х пар галилеевых систем (6) и (7), за которыми находятся объективы (8) с фокусным расстоянием 160 мм, которые образуют изображение объекта в фокальных плоскостях окуляров.

Общее линейное увеличение оптической системы, состоящей из объектива (5), галилеевых систем (6) и (7) и объективов (8) составляет: 0,6; 1; 2; 4; 7. За объективами (8) установлены 2 призмы Шмидта (9), которые позволяют разворачивать окулярные трубки по глазу наблюдателя без разворота изображения объектива.

	1 – источник света; 2 – отражатель; 3 – коллектор; 4 – предметный столик; 5 – объектив (F = 80 мм); 6, 7 – галилеевы системы; 8 – объективы (F = 160 мм); 9 – призмы Шмидта; 10 – окуляры.
Рис. 4. Оптическая схема микроскопа МБС-1

К микроскопу МБС-1 прилагаются 3 пары окуляров (10) с увеличением 6; 8; 12,5 и один окулярный микрометр 8-кратного увеличения с сеткой. Они позволяют варьировать общее увеличение микроскопа от 3,6 до 88 (табл. 1). Общее увеличение микроскопа – произведение увеличения окуляра на увеличение объектива.

Таблица 1.

Оптическая характеристика микроскопа МБС-1

Увеличение	Увеличение объектива

2. Оптическая система микроскопа.

3. Увеличение микроскопа.

4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа.

5. Полезное увеличение микроскопа.

6. Специальные приемы микроскопии.

7. Основные понятия и формулы.

8. Задачи.

Способность глаза различать мелкие детали предмета зависит от размеров изображения на сетчатке или от угла зрения. Для увеличения угла зрения используют специальные оптические приборы.

25.1. Лупа

Простейшим оптическим прибором для увеличения угла зрения является лупа, представляющая собой короткофокусную собирающую линзу (f = 1-10 см).

Рассматриваемый предмет помещают между лупой и ее передним фокусом с таким расчетом, чтобы его мнимое изображение находилось в пределах аккомодации для данного глаза. Обычно используют плоскости дальней или ближней аккомодации. Последний случай предпочтительнее, так как глаз не утомляется (кольцевая мышца не напряжена).

Сравним углы зрения, под которыми виден предмет, рассматриваемый «невооруженным» нормальным глазом и с помощью лупы. Расчеты выполним для случая, когда мнимое изображение предмета получается на бесконечности (дальний предел аккомодации).

При рассматривании предмета невооруженным глазом (рис. 25.1, а) для получения максимального угла зрения предмет нужно поместить на расстояние наилучшего зрения а 0 . Угол зрения, под которым при этом виден предмет, равен β = В/а 0 (В - размер предмета).

При рассматривании предмета с помощью лупы (рис. 25.1, б) его помещают в передней фокальной плоскости лупы. При этом глаз видит мнимое изображение предмета В", расположенное в бесконечно удаленной плоскости. Угол зрения, под которым видно изображение, равен β" ≈ В/f.

Рис. 25.1. Углы зрения: а - невооруженным глазом; б - с помощью лупы: f - фокусное расстояние лупы; N - узловая точка глаза

Увеличение лупы - отношение угла зрения β", под которым видно изображение предмета в лупе, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» нормальным глазом с расстояния наилучшего зрения:

Увеличения лупы для близорукого и дальнозоркого глаза разные, так как у них различны расстояния наилучшего зрения.

Приведем без вывода формулу для увеличения, которое дает лупа, используемая близоруким или дальнозорким глазом при формировании изображения в плоскости дальней аккомодации:

где а даль - дальний предел аккомодации.

Формула (25.1) позволяет предположить, что, уменьшая фокусное расстояние лупы, можно добиться сколь угодно большого увеличения. В принципе это так. Однако при уменьшении фокусного расстояния лупы и сохранении ее размеров возникают такие аберрации, которые сводят на нет весь эффект увеличения. Поэтому однолинзовые лупы обычно имеют 5-7-кратное увеличение.

Для уменьшения аберраций изготавливают сложные лупы, состоящие из двух-трех линз. В этом случае удается добиться 50-кратного увеличения.

25.2. Оптическая система микроскопа

Большее увеличение можно осуществить, рассматривая при помощи лупы действительное изображение предмета, создаваемое другой линзой или системой линз. Такое оптическое устройство реализовано в микроскопе. Лупу в этом случае называют окуляром, а другую линзу - объективом. Ход лучей в микроскопе показан на рис. 25.2.

Предмет В помещается вблизи переднего фокуса объектива (F об) с таким расчетом, чтобы его действительное, увеличенное изображение B" находилось между окуляром и его передним фокусом. При

Рис. 25.2. Ход лучей в микроскопе.

этом окуляр дает мнимое увеличенное изображение B", которое и рассматривает глаз.

Изменяя расстояние между предметом и объективом, добиваются того, чтобы изображение В" оказалось в плоскости дальней аккомодации глаза (в этом случае глаз не утомляется). Для человека с нормальным зрением В" располагается в фокальной плоскости окуляра, а В" получается на бесконечности.

25.3. Увеличение микроскопа

Основной характеристикой микроскопа является его угловое увеличение. Это понятие аналогично угловому увеличению лупы.

Увеличение микроскопа - отношение угла зрения β", под которым видно изображение предмета в окуляре, к углу зрения β, под которым предмет виден «невооруженным» глазом с расстояния наилучшего зрения (а 0):

25.4. Предел разрешения. Разрешающая способность микроскопа

Может сложиться впечатление, что, увеличивая оптическую длину тубуса, можно добиться сколь угодно большого увеличения и, следовательно, рассмотреть самые мелкие детали предмета.

Однако учет волновых свойств света показывает, что на размеры мелких деталей, различимых с помощью микроскопа, накладываются ограничения, связанные с дифракцией света, проходящего через отверстие объектива. Вследствие дифракции изображением освещенной точки оказывается не точка, а небольшой светлый кружок. Если рассматриваемые детали (точки) предмета расположены достаточно далеко, то объектив даст их изображения в виде двух отдельных кружков и их можно различить (рис. 25.3, а). Наименьшему расстоянию между различимыми точками соответствует «касание» кружков (рис. 25.3, б). Если точки расположены очень близко, то соответствующие им «кружки» перекрываются и воспринимаются как один объект (рис. 25.3, в).

Рис. 25.3. Разрешающая способность

Основной характеристикой, показывающей возможности микроскопа в этом отношении, является предел разрешения.

Предел разрешения микроскопа (Z) - наименьшее расстояние между двумя точками предмета, при котором они различимы как отдельные объекты (т.е. воспринимаются в микроскопе как две точки).

Величина, обратная пределу разрешения, называется разрешающей способностью. Чем меньше предел разрешения, тем больше разрешающая способность.

Теоретический предел разрешения микроскопа зависит от длины волны света, используемого для освещения, и от угловой апертуры объектива.

Угловая апертура (u) - угол между крайними лучами светового пучка, входящего в линзу объектива от предмета.

Укажем без вывода формулу для предела разрешения микроскопа в воздушной среде:

где λ - длина волны света, которым освещается объект.

У современных микроскопов угловая апертура достигает 140°. Если принять λ = 0,555 мкм, то получим для предела разрешения значение Z = 0,3 мкм.

25.5. Полезное увеличение микроскопа

Выясним, насколько большим должно быть увеличение микроскопа при заданном пределе разрешения его объектива. Примем во внимание, что у глаза имеется собственный предел разрешения, обусловленный строением сетчатки. В лекции 24 мы получили следующую оценку для предела разрешения глаза: Z ГЛ = 145-290 мкм. Для того чтобы глаз мог различить те же точки, которые разделяет микроскоп, необходимо увеличение

Это увеличение называют полезным увеличением.

Отметим, что при использовании микроскопа для фотографирования объекта в формуле (25.4) вместо Z ГЛ следует использовать предел разрешения пленки Z ПЛ.

Полезное увеличение микроскопа - увеличение, при котором предмет, имеющий размер, равный пределу разрешения микроскопа, имеет изображение, размер которого равен пределу разрешения глаза.

Используя полученную выше оценку для предела разрешения микроскопа Z м ≈0,3 мкм), найдем: Г п ~500-1000.

Добиваться большего значения для увеличения микроскопа не имеет смысла, так как никаких дополнительных деталей увидеть все равно не удастся.

Полезное увеличение микроскопа - это разумное сочетание разрешающих способностей и микроскопа, и глаза.

25.6. Специальные приемы микроскопии

Специальные приемы микроскопии используются для увеличения разрешающей способности (уменьшения предела разрешения) микроскопа.

1. Иммерсия. В некоторых микроскопах для уменьшения предела разрешения пространство между объективом и предметом заполняют специальной жидкостью - иммерсией. Такой микроскоп называют иммерсионным. Эффект иммерсии заключается в уменьшении длины волны: λ = λ 0 /n, где λ 0 - длина световой волны в вакууме, а n - показатель преломления иммерсии. В этом случае предел разрешения микроскопа определяется следующей формулой (обобщение формулы (25.3)):

Отметим, что для иммерсионных микроскопов создают специальные объективы, так как в жидкой среде изменяется фокусное расстояние объектива.

2. УФ-микроскопия. Для уменьшения предела разрешения используют коротковолновое ультрафиолетовое излучение, невидимое глазом. В ультрафиолетовых микроскопах микрообъект исследуется в УФлучах (в этом случае линзы выполняются из кварцевого стекла, а регистрация ведется на фотопленке или на специальном люминесцентном экране).

3. Измерение размеров микроскопических объектов. С помощью микроскопа можно определить размеры наблюдаемого объекта. Для этого применяют окулярный микрометр. Простейший окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, на которой нанесена шкала с делениями. Микрометр устанавливают в плоскости изображения, получаемого от объектива. При рассматривании в окуляр изображения объекта и шкалы сливаются, можно отсчитать, какое расстояние по шкале соответствует измеряемой величине. Предварительно определяют по известному объекту цену деления окулярного микрометра.

4. Микропроекция и микрофотография. С помощью микроскопа можно не только наблюдать объект через окуляр, но и фотографировать его или проецировать на экран. В этом случае применяют специальные окуляры, которые и проецируют промежуточное изображение A"B" на пленку или на экран.

5. Ультрамикроскопия. Микроскоп позволяет обнаружить частицы, размеры которых лежат за пределами его разрешения. Этот метод использует косое освещение, благодаря чему микрочастицы видны как светлые точки на темном фоне, при этом строение частиц увидеть нельзя, можно только установить факт их наличия.

Теория показывает, что, как бы силен не был микроскоп, всякий предмет размерами меньше 3 мкм будет представляться в нем просто как одна точка, без всяких подробностей. Но это не означает, что такие частицы нельзя видеть, следить за их движениями или считать их.

Для наблюдения частиц, размеры которых меньше предела разрешения микроскопа, служит приспособление, называемое ультрамикроскоп. Главную часть ультрамикроскопа составляет сильное осветительное приспособление; освещенные таким образом частицы наблюдаются в обыкновенном микроскопе. Ультрамикроскопия основана на том, что мелкие частицы, взвешенные в жидкости или газе, делаются видимыми при сильном боковом освещении (вспомним пылинки, видимые в солнечном луче).

25.8. Основные понятия и формулы

Окончание таблицы

25.8. Задачи

1. Линза с фокусным расстоянием 0,8 см используется в качестве объектива микроскопа с фокусным расстоянием окуляра, равным 2 см. Оптическая длина тубуса равна 18 см. Каково увеличение микроскопа?

2. Определить предел разрешения сухого и иммерсионного (n = 1,55) объективов c угловой апертурой u = 140 о. Длину волны принять равной 0,555 мкм.

3. Чему равен предел разрешения на длине волны λ = 0,555 мкм, если числовая апертура равна: А 1 = 0,25, А 2 = 0,65?

4. С каким показателем преломления следует взять иммерсионную жидкость, чтобы рассмотреть в микроскопе субклеточный элемент диаметром 0,25 мкм при наблюдении через оранжевый светофильтр (длина волны 600 нм)? Апертурный угол микроскопа 70°.

5. На ободке лупы имеется надпись «х10» Определить фокусное расстояние этой лупы.

6. Фокусное расстояние объектива микроскопа f 1 = 0,3 см, длина тубуса Δ = 15 см, увеличение Г = 2500. Найти фокусное расстояние F 2 окуляра. Расстояние наилучшего зрения a 0 = 25 см.

Похожие статьи